[小鼠淋巴细胞分离]淋巴细胞分离方法

发布时间:2017-7-19 15:39:00 编辑:goodook 手机版

范文一:小鼠淋巴细胞分离方法

小鼠淋巴细胞分离方法

一、实验用品的准备:

1. 采血用品:10ml注射器10个;手套20付;15ml离心管10个;20μl枪头、200μl枪头、1000μl枪头。摄子、剪刀各2把;加样器;70%酒精;5%碘酒;

2. 取脾用品:10ml注射器10个;手术器械10套;手套20付, 60mm玻璃培养皿10个;200 目尼龙网,裁成100mm×100mm正方形10块;10mL 玻璃注射器内活塞10个;5mL刻度吸管、15mL离心管、1640培养基;鼠淋巴细胞分离液;摄子、剪刀各10把;70%酒精;5%碘酒;移液器、离心机; 刀剪浸泡液(新洁尔灭);

注:红色必须灭菌;蓝色可以不灭菌;绿色需特殊处理;黑色不用灭菌。

二、相关实验:

(一)实验名称:分离小鼠脾脏淋巴细胞

实验目的:获得小鼠脾脏淋巴细胞,为ELISPOT实验做准备。

实验动物:BABALB/c小鼠;雌性

实验材料:

1.小鼠淋巴细胞分离液,

2.60mm玻璃培养皿

3.10mL 玻璃注射器内活塞,灭菌

4.气管切开包

5.5mL刻度吸管、15mL离心管、移液器、离心机

6.1640培养基

实验方法

1. 断颈处死小鼠,浸入75%的乙醇中浸泡1-2分钟。

2. 在超净台中小心剪开小鼠的腹部外皮,用大头针固定,再剪开小鼠的腹腔,用镊子取出小鼠脾脏。注意无菌操作。

3. 在培养皿中放入3mL1640基础培养基,将小鼠脾脏放入培养皿中,用1ml注射器吸取小鼠淋巴细胞分离液,注入小鼠脾脏,直至完全分离。

4. 把悬有脾脏细胞的1640培养基缓慢转移到装有6 mL淋巴细胞分离液的15 mL离心管中。

5. 3000转离心15分钟。(病毒室离心机)

6.吸出淋巴细胞层,加入5mL 1640培养基洗涤一次,1500转离心10 分钟。

7.倾倒上清液,加入3-5mL5ml5%FCS1640培养基重悬,细胞计数。

8.对获得的小鼠脾脏淋巴细胞进行 ELSPOT 检测。

实验试剂用量:

1. 小鼠淋巴细胞分离液:60 mL

2. 1640基础培养基:80 mL

3. 5%FCS1640培养基:50Ml



范文二:脾脏淋巴细胞分离方法

小鼠脾脏淋巴细胞分离方法

需要提前准备的材料:

提前高压灭菌:手术器械,200目尼龙网,

除菌过滤:8.5%和0.85%的Nacl溶液各40ml,1XPBS溶液,hanks液40ml。

红细胞裂解液,六孔板,培养皿,75%酒精,100ml烧杯,无菌注射器5-10ml,15ml、50ml离心管,4mlEP管,离心机等。

100%percoll液(简称工作液):13.5ml percoll原液+1.5 ml 8.5%Nacl溶液混匀备用。

70%percoll液(1.090g/ml):2.1 ml工作液+0.9 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用 60%percoll液(1.077g/ml):1.8 ml工作液+1.2 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用 50%percoll液(1.067g/ml):1.5 ml工作液+1.5 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用 40%percoll液(1.050g/ml):1.2 ml工作液+1.8 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用 30%percoll液(1.043g/ml):0.9 ml工作液+2.1 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用 20%percoll液(1.031g/ml):0.6 ml工作液+2.4 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用

找一只15ml离心管,从低到高(20% percoll液→70%percoll液)依次装入,装好备用。

(1)颈椎脱臼处死小鼠。75%酒精浸泡10min

(2)无菌条件下取出小鼠脾脏,去除筋膜等置于Hanks’ 液中,将脾脏放入2ml离心管中剪碎。

(3)将200目尼龙网置于六孔板上,用注射器头研磨,过程中不停加Hanks’ 液冲洗。

(4)收集脾细胞悬液置于离心管中,1500rpm 10min,弃上清。

(5)加10ml?红细胞裂解液混悬沉淀,室温静置10min,再1500rpm 10min

(6)洗三遍,1500rpm 5min,离心去上清

(7)加入2ml 0.85%Nacl溶液混悬沉淀。

(8)用注射器缓慢沿着事先准备好的梯度分离管中,水平离心1800-2000rpm 30-40min

(9)收集想要的分层,用1xPBS洗3遍

(10)用完全RPMI-1640培养基混悬沉淀,(调成浓度为1×108/ml的细胞悬液)转入培养皿中,置37℃,5%CO2下孵育30min后(去除贴壁的细胞),收获未贴壁细胞

注:贴壁为单核细胞(巨噬细胞,树突细胞)

不贴壁的悬浮细胞(T/B/NK细胞)

附件1:

(一) 原理

Percoll是一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒。渗透压很低(

范文三:淋巴细胞分离的实验方法

肝脏免疫学实验室淋巴细胞分离技术

肝脏淋巴细胞分离

1. 小鼠摘眼球放血后,剪开颈动脉处死,摘取肝脏。

2. 将肝脏放在200目钢丝网上自边缘开始研磨,转至15ml离心管中。 3. 650rpm×1min离心,将上层液体转至15ml离心管中。 4. 1500prm×5min离心后弃上清,重复洗两次。 5. 6ml 40% Percoll 溶液重悬沉淀,将3ml 70% Percoll溶液加于其底层,2000rpm×20min,

升6降2。

6. 吸取两层Percoll溶液之间的白细胞层至15ml离心管中,加满PBS后2000rpm×5min

离心收集细胞。

7. 1ml PBS 重悬细胞后,吸取10ul细胞悬液,按照1:1的比例与台盼蓝混匀后计数。

脾脏淋巴细胞分离

1. 小鼠摘眼球放血后剪开颈动脉处死,摘取脾脏。

2. 用载玻片的粗糙面将脾脏一点一点磨碎,将收集的研磨悬液通过200目尼龙网过滤至

15ml离心管中,1500rpm×5min离心收集细胞。

3. 8ml PBS重悬细胞沉淀,在底层加入3ml Ficoll , 2000rpm×20min,升6降2。

4. 吸取两层溶液之间的白细胞层至15ml离心管,加满PBS后2000rpm×5min离心收集

细胞。

5. 6-8 ml PBS 重悬细胞后,吸取10ul细胞悬液,按照1:1的比例与台盼蓝混匀后计数。

胸腺淋巴细胞分离

1. 小鼠摘眼球放血后,剪开颈动脉处死,摘取胸腺。 2. 将胸腺放在200目钢丝网上研磨,将收集的研磨悬液通过尼龙网过滤至15ml离心管中,

1500rpm×5min离心收集细胞。 3. 6-8ml PBS 重悬细胞沉淀,再次通过200目尼龙网过滤后,吸取10ul细胞悬液,按照1:

1的比例与台盼蓝混匀后计数。

淋巴结淋巴细胞分离

1. 小鼠摘眼球放血后脱臼处死,摘取淋巴结。

2. 用载玻片的粗糙面将淋巴结磨碎,将收集的研磨悬液通过200目尼龙网过滤至15ml

离心管中,1500rpm×5min离心收集细胞。 3. 6-8ml PBS (按照细胞团的大小凭经验确定)重悬细胞沉淀,通过200目尼龙网过滤后,

吸取10ul细胞悬液,按照1:1的比例与台盼蓝混匀后计数。

骨髓淋巴细胞分离

1. 小鼠摘眼球放血后,剪开颈动脉处死。

2. 将脚踝处皮肤剪开至大腿根部,暴露腿部肌肉,清理肌肉后将腿骨从大腿关节和脚踝

处剪断,用纱布捏住腿骨,脚踝一端向上,剔除肌肉和软骨,将两段腿骨分开。 3. 用注射器将骨髓从腿骨较粗一头吹打出,将液体通过尼龙网过滤至15ml离心管中,

1500rpm×5min离心收集细胞。

4. 8ml PBS重悬细胞沉淀,在底层加入3ml Ficoll, 2000rpm×20min,升6降2。

5. 吸取两层溶液之间的白细胞层至15ml离心管中,加满PBS后1260g×5min离心收集细

胞。

6. 1ml PBS 重悬细胞后,吸取10ul细胞悬液,按照1:1的比例与台盼蓝混匀后计数。

第一版补充说明:

? 这里的离心速度做了一些修改:本来700rpm 应该对应99g,这里改为100g;本来

2000rpm对应805g,这里下调到800g,这可以根据后来的需要修改;2500rpm一律对应为1260g。

? 实验室的离心机型号为Eppendorf 5810R ,离心程序说明:

Prog NO.

1 2 3 4

Rcf 100g 800g 1260g 1260g

Time

1min 5min 20min 5min

UP ~ ~ ↗ 6 ~

DOWN ~ ~ ↘ 2 ~

? Percoll原液(9V)加 10×PBS(1V)配制为Percoll贮存液(Stock Percoll)

X Percoll 10ml

40% 70%

1×PBS(ml)

6 3

Stock Percoll (ml)

4 7

第二版补充说明:

? 这里的离心速度做了一些修改:这里的离心速度做了较大的修改,红色标注 ?

? 实验中离心程序的改变致力于解决肝脏细胞总是分离不到106 的量级,选择小的离心速

度取得了不错的效果。

? 离心机的编程Programming:

Storing a ?xed program (only possible when the device is at a standstill): It is possible to save a maximum of 35 ?xed programs (1...9, A...Z)..

Enter the program data to be used ?rst by pressing the parameter keys and the arrow keys or use the data from the last run. The at set rpm functions and the set deceleration ramp can also be saved in a program if necessary.

Press the key twice ? the ?rst free program no., indicated

by P..., appears in the display and ?ashes.

Use OR to select the desired free program number (1...9, A...Z) can be selected.

Hold down the key for two seconds until appears in the display. The previously set parameters of Temp., Speed, Time, etc. are now saved as a data set.

If parameters are modi?ed during the run with a ?xed program, 0 appears in the PROG ?eld and the user exits program without it being modi?ed.

To exit the ?xed program, call up program 0 or modify the parameters.

? 选择已有的程序进行离心Preset program:

Programs can only be preselected when the device is at a standstill.

Press the key once ? the program no. that has been set ?ashes.

? ?

0 indicates data from last run. 1...9, A...Z indicate fixed programs.

Use to select further program numbers.

Returns to program 0 or leaves the programming mode when the lid is open. In order to start the selected program immediately, the centrifuge lid must be closed prior to pressing the key.

? 对已有的程序进行删除操作 Write protection:

deleted while the lid is open prior to renewed assignment of a program number.

Press the key once ? the program NO. display ?ashes. Use OR to select the program no. which is to be deleted. Press within 10 seconds, keep depressed for 2 seconds

until cleared appears in the display.



范文四:人外周血淋巴细胞分离方法

1.实验前准备

2.使用方法说明及图例

2.1血液样本分离液使用说明及图例

2.2组织分离液使用说明及图例

3.HES-TBD550使用说明

4.组织单细胞悬液的制备

5.注意事项

6.性能指标

7. 生产企业

8. 参考文献

5. 注意事项

A. 本分离液是敏光型的,在运输和贮藏过程中应在18℃-

25℃避光保存,启封后置4℃保存避免微生物污染。另外,本品为真空包装,未启封前置于

10℃ 以下易出现白色结晶,影响分离效果。

B.

待分离的血液、组织及细胞要求新鲜,避免冷冻和冷藏。分离液和所分离样本一定在20℃

水浴箱中复温20分钟保证分离液和所分离样本温度在20℃±2℃时分离效果最好,且所有操

作过程一定要在无菌条件下进行。

C.

由于各品牌离心机的性能不同,国内南北地区温度环境和四季的差异,可能影响分离效果

,用户可以调节离心转数,调节离心的时间,摸索最佳的分离条件(具体分离条件各实验

室自定)。

D. 最好使用无静电反应的离心管,推荐使用未经过碱处理的玻璃离心管。

E.

最优抗凝剂选择:EDTA、枸橼酸、肝素。应注意在血液稀释过程中应去除抗凝剂体积。

F.

分离过程中所用其他试剂如:羟乙基淀粉550、全血及组织稀释液、细胞洗涤液及红细胞裂

解液等以我公司产品为最优选择,本公司相关系列产品无菌、无病毒、无支原体、低内毒素水平且无细胞毒性,所获得的细胞可保持完好的生物活性和完整的细胞形态。

pH   7.0-7.5

渗透压  280-340mOsmol/kg

内毒素 ≤0.5EU/ml

无菌 直接接种培养14天后培养基澄清

澄明度及不溶性颗粒物 每50ml溶液中含10μm以上的不溶性微粒20粒以下,含25μm以上的不溶性微粒5粒以下贮藏及保存期限

18℃-25℃避光保存,有效期两年。启封后置4℃保存,有效期一周。

注:若保证无微生物污染,启封后可置4℃长期保存。但应注意保存温度较低时本分离液易

出现白色结晶,影响分离效果。

1. 实验前准备

A.试剂

淋巴细胞分离液、全血及组织稀释液、细胞洗涤液、羟乙基淀粉550、胎牛血清

B.器材

玻璃离心管、玻璃滴管

水平转子离心机、无菌工作台

2. 使用方法说明及图例

2.1 血液样本分离液使用说明及图例

A. 小量分离-使用1-2ml新鲜抗凝血(分离图例见图例1):

a. 取新鲜抗凝血1-2ml,与全血及组织稀释液(Cat#:2010C1119)1:1 混匀;

b. 小心加于与混合液等体积的细胞分离液(货号:LTS1077)之液面上;

c. 以400g(约1500转/分)离心15分钟(半径15cm水平转子);

第二层细胞放入含4-

5ml细胞洗涤液(Cat#:2010X1118)的试管中,充分混匀后,以500g(约1800转/分)离心

20分钟,弃去上清留沉淀细胞重新悬起。重复洗涤2次即得所需细胞。B. 中量分离-使用5-10ml新鲜抗凝血(分离图例见图例1):

a. 取新鲜抗凝血5-10ml,与全血及组织稀释液(Cat#:2010C1119)1:1 混匀;b. 将混合液小心叠加于细胞分离液之液面上(混合液:分离液=2:1);

c. 以500g(约1800转/分)离心15分钟(半径15cm水平转子);

第二层细胞放入含10ml

细胞洗涤液(Cat#:2010X1118)的试管中,充分混匀后,以500g(约1800转/分)离心20

分钟,弃去上清留沉淀细胞重新悬起。重复洗涤2次即得所需细胞。C. 大量分离I-使用20ml新鲜抗凝血(分离图例见图例2):

a. 取新鲜抗凝血20ml以200g(约1100转/分)离心20分钟弃去血浆;

b. 向弃去血浆的血细胞中加入全血及组织稀释液(Cat#:2010C1119)12ml 小心混匀;

c. 将混合液小心叠加于细胞分离液之液面上(混合液:分离液=2:1);

d. 以600g(约2000转/分)离心15分钟(半径15cm水平转子);

第二层细胞放入含20ml

细胞洗涤液(Cat#:2010X1118)的试管中,充分混匀后,以500g(约1800转/分)离心20

分钟,弃去上清留沉淀细胞重新悬起。重复洗涤2次即得所需细胞。D. 大量分离II-使用50ml新鲜抗凝血(分离图例见图例3):

a. 取新鲜抗凝血50ml

30分钟。吸取混浊的上清液备用,弃去底部红细胞。

b. 将步骤1中留取的上清液以200g(约1100转/分)离心20分钟弃去上清保留沉淀细胞;

c. 向沉淀的细胞中加入全血及组织稀释液(Cat#:2010C1119)20ml 小心混匀;

d. 将混合液小心叠加于细胞分离液之液面上(混合液:分离液=2:1);

e. 以600g(约2000转/分)离心15分钟(半径15cm水平转子);

收集第二层细胞放入含20ml

细胞洗涤液(Cat#:2010X1118)的试管中,充分混匀后,以500g(约1800转/分)离心20

分钟,弃去上清留沉淀细胞重新悬起。重复洗涤2次即得所需淋巴细胞。

注:提取率大于90%。

?血液(人)中各细胞含量参考值:红细胞

白细胞男:4.0-5.5×1012/L(400-550万个/mm3)女:3.5-5.0×1012/L(350-500万个/mm3)新生儿:6.0-7.0×1012/L(600-700万个/mm3)成人:4.0-10.0×109/L(4000-10000个/mm3)

新生儿:15.0-20.0×109/L(15000-20000个/mm3)

血小板100-300×10

9

/L(10万-30万个/mm3)

名称占白细胞总数百分比

嗜中性粒细胞30%-70%

白细胞分类计嗜酸性粒细胞0.5%-5%

数嗜碱性粒细胞0%-1%

淋巴细胞20%-40%

单核细胞3%-8%

分离图例3

抗凝血50ml与HES-TBD550 1:1混合后再与1份注射用生理盐水混匀20℃-30℃静置20-30分钟

2.2 组织分离液使用说明及图例

A.取组织匀浆单细胞悬液(细胞浓度为2×108-

1×109个/ml,具体制备方法参照“10.组织单细胞悬液的制备”)2ml,小心加于2ml细胞

分离液之液面上;

B.以400g(约1500转/分)离心15分钟(半径15cm水平转子);

第二层细胞放入

含4-

5ml细胞洗涤液(Cat#:2010X1118)的试管中,充分混匀后,以500g(约1800转/分)离心

20分钟,弃去上清留沉淀细胞重新悬起。重复洗涤2次即得所需淋巴细胞。3. HES-TBD550使用说明

HES

是从支链淀粉衍生出来的,是富含淀粉的复合物,其生理和化学特性主要由羟乙基取代度

即取代级、平均分子量决定。大量实验表明平均分子量越大对红细胞的凝集作用越强,有效提高红细胞的沉降速度,从而使红细胞与其它细胞分离。故而,使用HES-

TBD550(羟乙基淀粉 550)沉淀法是一种高效的细胞分离方法。

间充质干细胞(mesenchymal stem cells ,MSCs)

是指一群可向成骨细胞、成脂肪细胞、骨髓基质细胞、肝脏细胞、心肌细胞和神经细胞等

多种细胞分化的多潜能组织干细胞,是在细胞治疗、基因治疗中有效发挥作用的理想工程细

胞。MSCs

不仅存在于骨髓,也可从脐血、外周血中以及脂肪组织、肌肉、胎儿器官、大脑、牙齿中分

离。UCB - MSCs

的分离、筛选、增殖、分化与脐血样本的选择、培养基的差异以及分离、扩增分化过程中

操作技术等多种因素有关。目前用于UCB - MSCs

分离的方法有:贴壁筛选法、密度梯度离心法、流式细胞仪法和免疫磁珠法。流式细胞仪法

对细胞损伤较大,免疫磁珠法价格相对较贵且由于抗原抗体反应也容易改变细胞原有特性

,而HES-TBD550(羟乙基淀粉 550)联合密度梯度离心法常与贴壁筛选法结合使用,可提高所得 UCB - MSCs

的纯度,目前研究多采用此法。国内不少学者采用羟乙基淀粉沉淀红细胞,然后再进行离

心分离单个核细胞,也取得不错结果。实验证明采用随机数字表法,将每份脐血随机分入

两个不同处理组,从而将脐血样本的个体差异减小到最小程度。结果证实,HES-

TBD550(羟乙基淀粉 550)联合密度梯度离心法获得的有核细胞数量明显多于 FICOLL

密度梯度离心法。本实验采用的羟乙基淀粉商品名为

550),克分子渗透压为308mosm/L,胶体渗透压为68/36 HES-TBD550(羟乙基淀粉 mmHg,可影响红细胞集聚性沉降率。红细胞集聚是可递性桥接结构形成的结果,由大的HES-

TBD550(羟乙基淀粉 550)分子处在红细胞之间联接而成。HES-TBD550(羟乙基淀粉 550)同时还阻碍白细胞和内皮细胞的黏附,并使平均血小板容积呈现微弱地降低,从而有

轻度抑制血小板集聚的功能。脐血经HES-TBD550(羟乙基淀粉 550)处理后,可使红细胞沉积至试管底,对其它主要成分包括干细胞无影响。经这样处理

后,实验时间相对较短(平均为1.5

h),步骤相对较少,细胞污染几率小,从而使细胞数损失减少。结论证明,与相应的干细

胞分离液联合分离使用羟乙基淀粉沉淀法是一种高效的脐血干细胞分离方法。

4. 组织单细胞悬液的制备

注:A.

本说明只提供机械匀浆制备单细胞悬液的方法,酶消化法由于各实验室选取的消化酶种类

各不相同,请各实验室自行选择进行试验。

B. 全过程及所需试剂要求无菌环境。

剪碎法:将组织块放入平皿后,加入少量组织匀浆液及20%胎牛血清;用眼科剪将组织剪至

匀浆状,加入5ml组织匀浆液及20%胎牛血清;用吸管吸取组织匀浆,用100目不锈钢滤网(

另购)过滤到试管内;离心沉淀1500转/分×3

min,再用细胞洗涤液清洗3次,每次以500rpm短时低速离心除去细胞碎片,以200目不锈钢

滤网(另购)过滤去细胞团块。作细胞计数并调整细胞浓度为(2~5)×107个/ml。常温

下放置,

待测细胞的活力。分离前用20%胎牛血清或全血及组织稀释液悬起细胞浓度为2×108-

1×109个/ml的单细胞悬液备用。

匀浆器法:用眼科剪将组织剪成小块;放入70ml组织研磨器内,加入2ml组织匀浆液及20%

胎牛血清;缓慢转动研棒,研磨至匀浆;用5ml组织匀浆液及20%胎牛血清冲洗研器;收集

细胞悬液,经200目不锈钢滤网(另购)过滤;离心沉淀800rpm×2min

,再用细胞洗涤液洗3次,离心沉淀。作细胞计数并调整细胞浓度为(2~5)×107个/ml。

常温下放置,

待测细胞的活力。分离前用20%胎牛血清或全血及组织稀释液悬起细胞浓度为2×108-

1×109个/ml的单细胞悬液备用。

细胞计数方法:

细胞计数法是用来计数细胞悬液中细胞数量的一种方法。一般利用计数板(血球计数

板)进行。既可用于分离(散)细胞培养接种前计数所制备的细胞悬液中的细胞数量,也

可用于对培养物的细胞数量进行计数。不论计数的对象如何,均须制备分散的细胞悬液。

计数与计算过程

1)、在细胞计数板中央放置计数专用的盖玻片。

2)、用玻璃虹吸管吸取细胞,让虹吸管在盖玻片上或下侧的计数板凹蹧处流出悬液,

至盖玻片被液体充满为止。

3)、置显微镜下计数四角大方格内的细胞总数。对于压线的细胞只计数在上线和左线

者,对于细胞团按单个细胞计数。

4)、按下式计数细胞悬液的密度:

细胞密度=(4个大格细胞总数/4)×104个/ml×稀释倍数

公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为:

1.0mm(长)×1.0mm(宽)×0.1mm(高)=0.1mm3 而 1ml=1000mm3

细胞计数要点:

A.

进行细胞计数时,要求悬液中细胞数目不低于104个/ml,如果细胞数目很少要进行离心再

悬浮于少量培养液中;显微镜下计数时,遇到2个以上细胞组成的细胞团,应按单个细胞计

算。如果细胞团>10%,说明细胞分散不充分; 或细胞数500个/10 mm2

时,说明稀释不当,需重新制备细胞悬液。

B. 要求细胞悬液中的细胞分散良好,否则影响计数准确性。

C.

取样计数前,应充分混匀细胞悬液,尤其是多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀,

以求计数准确;

D.

数细胞的原则是只数完整的细胞,若细胞聚集成团时,只按照一个细胞计算。如果细胞压

在格线上时,则只计上线,不计下线,只计左线,不计右线。

E. 操作时,注意盖玻片下不能有气泡,也不能让悬液流入旁边槽中,否则要重新计数。

初学者易犯的错误:

A. 计数前未将待测悬液吹打均匀。

B. 滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。

C. 滴入悬液时的量太多,至使细胞悬液流入旁边的槽中。

5. 注意事项

A. 本分离液是敏光型的,在运输和贮藏过程中应在18℃-

25℃避光保存,启封后置4℃保存避免微生物污染。另外,本品为真空包装,未启封前置于

10℃ 以下易出现白色结晶,影响分离效果。

B.

待分离的血液、组织及细胞要求新鲜,避免冷冻和冷藏。分离液和所分离样本一定在20℃

水浴箱中复温20分钟保证分离液和所分离样本温度在20℃±2℃时分离效果最好,且所有操

作过程一定要在无菌条件下进行。

C.

由于各品牌离心机的性能不同,国内南北地区温度环境和四季的差异,可能影响分离效果

,用户可以调节离心转数,调节离心的时间,摸索最佳的分离条件(具体分离条件各实验

室自定)。

D. 最好使用无静电反应的离心管,推荐使用未经过碱处理的玻璃离心管。

E.

最优抗凝剂选择:EDTA、枸橼酸、肝素。应注意在血液稀释过程中应去除抗凝剂体积。

F.

分离过程中所用其他试剂如:羟乙基淀粉550、全血及组织稀释液、细胞洗涤液及红细胞裂

解液等以我公司产品为最优选择,本公司相关系列产品无菌、无病毒、无支原体、低内毒素水平且无细胞毒性,所获得的细胞可保持完好的生物活性和完整的细胞形态。

pH   7.0-7.5

渗透压  280-340mOsmol/kg

内毒素 ≤0.5EU/ml

无菌 直接接种培养14天后培养基澄清

澄明度及不溶性颗粒物 每50ml溶液中含10μm以上的不溶性微粒20粒以下,含25μm以上的不溶性微粒5粒以下贮藏及保存期限

18℃-25℃避光保存,有效期两年。启封后置4℃保存,有效期一周。

注:若保证无微生物污染,启封后可置4℃长期保存。但应注意保存温度较低时本分离液易出现白色结晶,影响分离效

果。

8. 生产企业

企业名称:天津市灏洋生物制品科技有限责任公司

地址:中国医学科学院生物医学工程研究所2号楼2层

天津市南开区白堤路 236 号 201-216(科技园)

邮政编码:300192

电话:15822121119 15822691119

传真:022-87894017

网址:www.tbdscience.com

邮箱:gx15822121119@163.com

9. 参考文献

[1] Meier C, Middelanis J, Wasielewski B, et al. Spastic paresis after

perinatal brain damage in rats Is reduced by human cord blood mononuclear

cells[J]. Pediatric Research, 2006,59(2):244-249.

[2] Boyle AJ, Schulman SP, Hare JM , et al. Stem cell therapy for cardiac

repair:ready for the next step[J]. Circulation, 2006, 114(4):339-352.

[3] 程范军,邹 萍,杨汉东,等.人脐血间充质干/

祖细胞诱导为心肌样细胞的实验研究[J]. 中华器官移植杂志,2003,24:220-222.

[4]Dennis JE,Charbord P.Origin and differentiation of human and murine stroma [J].Stem Cells,2002,20(3):205.

[5] Yu JC, Daniel TS, Ching PT, et al. Disparate mesenchyme-lineage

tendencies in mesenchymal stem cells from human bone marrow and Umbilical Cord

Blood[J]. Stem Cells, 2006,24(3) : 679-685.

[6] Compagnoli C, Roberts IAG, Kumar S, et al. Identification of mesenchymal

stem/progenitor cells in human first trimester fetal blood, liver and bone

marrow[J]. Blood, 2001,98:2396-2402.

[7] Miura M, Gronthos S, Zhao M, et al. SHED: stem cells from human

exfoliated deciduous teeth[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2003,100:5807–5812.

[8] 迟作华, 张 洹, 何冬梅, 等. 脐血间充质干细胞培养条件的优化[J].

中国实用内科杂志,2006, 26(5):372-375.

[9] 向 静, 江德鹏, 王昌铭,等.

的表达[J]. 脐血单个核细胞体外培养和诱导后神经干细胞标志物mRNA

重庆医科大学学报,2005 ,30 (3):352-355.

[10] 孙海梅,季凤清,李荣平,等.不同培养条件下人脐血间充质干细胞的差异[J].

***,2006, 10( 45 ):51-53.

[11] 朱美玲,伍新尧,陈汝光,等.不同分离方法分离脐血造血细胞效率的比较[J].

中国输血杂志,2002 , 15 (3):179-780.

[12]

郑德先,吴克复,褚建新.现代实验血液学研究方法与技术.北京医科大学中国协和医科大

学联合出版社,1999.

[13] 鄂征.组织培养.北京出版社,1995.

[14] 朱立平,陈学清.免疫学常用实验方法.人民军医出版社,2000.

范文五:大鼠外周血淋巴细胞分离方法

1.实验前准备

2.使用方法说明及图例

2.1血液样本分离液使用说明及图例

3.HES-TBD550使用说明

4.注意事项

5.性能指标

6.细胞计数方法与要点

7.初学者易犯的错误

8.生产企业

9.参考文献

1. 实验前准备

A.试剂

大鼠外周血淋巴细胞分离液、全血及组织稀释液、细胞洗涤液、羟乙基淀粉550、胎

牛血清

B.器材

玻璃离心管、玻璃滴管

水平转子离心机、无菌工作台

2. 使用方法说明及图例

2.1 血液样本分离液使用说明及图例

A. 小量分离-使用1-2ml新鲜抗凝血(分离图例见图例1):

a. 取新鲜抗凝血1-2ml,与全血及组织稀释液(Cat#:2010C1119)1:1 混匀;

b. 小心加于与混合液等体积的细胞分离液(货号:LTS1083)之液面上;

c. 以400g(约1500转/分)离心15分钟(半径15cm水平转子);

第二层细胞放入含4-

5ml细胞洗涤液(Cat#:2010X1118)的试管中,充分混匀后,以500g(约1800转/分)离心

20分钟,弃去上清留沉淀细胞重新悬起。重复洗涤2次即得所需细胞。B. 中量分离-使用5-10ml新鲜抗凝血(分离图例见图例1):

a. 取新鲜抗凝血5-10ml,与全血及组织稀释液(Cat#:2010C1119)1:1 混匀;

b. 将混合液小心叠加于细胞分离液之液面上(混合液:分离液=2:1);

c. 以500g(约1800转/分)离心15分钟(半径15cm水平转子);

第二层细胞放入含10ml

细胞洗涤液(Cat#:2010X1118)的试管中,充分混匀后,以500g(约1800转/分)离心20

分钟,弃去上清留沉淀细胞重新悬起。重复洗涤2次即得所需细胞。C. 大量分离I-使用20ml新鲜抗凝血(分离图例见图例2):

a. 取新鲜抗凝血20ml以200g(约1100转/分)离心20分钟弃去血浆;

b. 向弃去血浆的血细胞中加入全血及组织稀释液(Cat#:2010C1119)12ml 小心混匀;

c. 将混合液小心叠加于细胞分离液之液面上(混合液:分离液=2:1);

d. 以600g(约2000转/分)离心15分钟(半径15cm水平转子);

第二层细胞放入含20ml

细胞洗涤液(Cat#:2010X1118)的试管中,充分混匀后,以500g(约1800转/分)离心20

分钟,弃去上清留沉淀细胞重新悬起。重复洗涤2次即得所需细胞。D. 大量分离II-使用50ml新鲜抗凝血(分离图例见图例3):

a. 取新鲜抗凝血50ml

30分钟。吸取混浊的上清液备用,弃去底部红细胞。

b. 将步骤1中留取的上清液以200g(约1100转/分)离心20分钟弃去上清保留沉淀细胞;

c. 向沉淀的细胞中加入全血及组织稀释液(Cat#:2010C1119)20ml 小心混匀;

d. 将混合液小心叠加于细胞分离液之液面上(混合液:分离液=2:1);

e. 以600g(约2000转/分)离心15分钟(半径15cm水平转子);

收集第二层细胞放入含20ml

细胞洗涤液(Cat#:2010X1118)的试管中,充分混匀后,以500g(约1800转/分)离心20

分钟,弃去上清留沉淀细胞重新悬起。重复洗涤2次即得所需淋巴细胞。

注:提取率大于90%。

?血液(人)中各细胞含量参考值:红细胞男:4.0-5.5×1012/L(400-550万个/mm3)

白细胞

血小板

白细胞分类计

数女:3.5-5.0×10

12

/L(350-500万个/mm3)新生儿:6.0-7.0×1012/L(600-700万个/mm3)成人:4.0-10.0×109/L(4000-10000个/mm3)新生儿:15.0-20.0×109/L(15000-20000个/mm3)100-300×109/L(10万-30万个/mm3)名称占白细胞总数百分比嗜中性粒细胞30%-70%嗜酸性粒细胞0.5%-5%嗜碱性粒细胞0%-1%

淋巴细胞20%-40%

单核细胞3%-8%

分离图例3

抗凝血50ml与HES-TBD550 1:1混合后再与1份注射用生理盐水混匀20℃-30℃静置20-30分钟

3. HES-TBD550使用说明

HES

是从支链淀粉衍生出来的,是富含淀粉的复合物,其生理和化学特性主要由羟乙基取代度

即取代级、平均分子量决定。大量实验表明平均分子量越大对红细胞的凝集作用越强,有

效提高红细胞的沉降速度,从而使红细胞与其它细胞分离。故而,使用HES-

TBD550(羟乙基淀粉 550)沉淀法是一种高效的细胞分离方法。

间充质干细胞(mesenchymal stem cells ,MSCs)

是指一群可向成骨细胞、成脂肪细胞、骨髓基质细胞、肝脏细胞、心肌细胞和神经细胞等

多种细胞分化的多潜能组织干细胞,是在细胞治疗、基因治疗中有效发挥作用的理想工程细

胞。MSCs

不仅存在于骨髓,也可从脐血、外周血中以及脂肪组织、肌肉、胎儿器官、大脑、牙齿中分

离。UCB - MSCs

的分离、筛选、增殖、分化与脐血样本的选择、培养基的差异以及分离、扩增分化过程中

操作技术等多种因素有关。目前用于UCB - MSCs

分离的方法有:贴壁筛选法、密度梯度离心法、流式细胞仪法和免疫磁珠法。流式细胞仪法

对细胞损伤较大,免疫磁珠法价格相对较贵且由于抗原抗体反应也容易改变细胞原有特性

,而HES-TBD550(羟乙基淀粉 550)联合密度梯度离心法常与贴壁筛选法结合使用,可提高所得 UCB - MSCs

的纯度,目前研究多采用此法。国内不少学者采用羟乙基淀粉沉淀红细胞,然后再进行离

心分离单个核细胞,也取得不错结果。实验证明采用随机数字表法,将每份脐血随机分入

两个不同处理组,从而将脐血样本的个体差异减小到最小程度。结果证实,HES-

TBD550(羟乙基淀粉 550)联合密度梯度离心法获得的有核细胞数量明显多于 FICOLL

密度梯度离心法。本实验采用的羟乙基淀粉商品名为

550),克分子渗透压为308mosm/L,胶体渗透压为68/36

HES-TBD550(羟乙基淀粉

mmHg,可影响红细胞集聚性沉降率。红细胞集聚是可递性桥接结构形成的结果,由大的HES-

TBD550(羟乙基淀粉 550)分子处在红细胞之间联接而成。HES-TBD550(羟乙基淀粉 550)同时还阻碍白细胞和内皮细胞的黏附,并使平均血小板容积呈现微弱地降低,从而有

轻度抑制血小板集聚的功能。脐血经HES-TBD550(羟乙基淀粉 550)处理后,可使红细胞沉积至试管底,对其它主要成分包括干细胞无影响。经这样处理

后,实验时间相对较短(平均为1.5

h),步骤相对较少,细胞污染几率小,从而使细胞数损失减少。结论证明,与相应的干细

胞分离液联合分离使用羟乙基淀粉沉淀法是一种高效的脐血干细胞分离方法。

4. 注意事项

A. 本分离液是敏光型的,在运输和贮藏过程中应在18℃-

25℃避光保存,启封后置4℃保存避免微生物污染。另外,本品为真空包装,未启封前置于

10℃ 以下易出现白色结晶,影响分离效果。

B.

待分离的血液、组织及细胞要求新鲜,避免冷冻和冷藏。分离液和所分离样本一定在20℃

水浴箱中复温20分钟保证分离液和所分离样本温度在20℃±2℃时分离效果最好,且所有操

作过程一定要在无菌条件下进行。

C.

由于各品牌离心机的性能不同,国内南北地区温度环境和四季的差异,可能影响分离效果

,用户可以调节离心转数,调节离心的时间,摸索最佳的分离条件(具体分离条件各实验

室自定)。

D. 最好使用无静电反应的离心管,推荐使用未经过碱处理的玻璃离心管。

E.

最优抗凝剂选择:EDTA、枸橼酸、肝素。应注意在血液稀释过程中应去除抗凝剂体积。

F.

分离过程中所用其他试剂如:羟乙基淀粉550、全血及组织稀释液、细胞洗涤液及红细胞裂

解液等以我公司产品为最优选择,本公司相关系列产品无菌、无病毒、无支原体、低内毒素水平且无细胞毒性,所获得的细胞可保持完好的生物活性和完整的细胞形态。

pH   7.0-7.5

渗透压  280-340mOsmol/kg

内毒素 ≤0.5EU/ml

无菌 直接接种培养14天后培养基澄清

澄明度及不溶性颗粒物 每50ml溶液中含10μm以上的不溶性微粒20粒以下,含25μm以上的不溶性微粒5粒以下贮藏及保存期限

18℃-25℃避光保存,有效期两年。启封后置4℃保存,有效期一周。

注:若保证无微生物污染,启封后可置4℃长期保存。但应注意保存温度较低时本分离液易

出现白色结晶,影响分离效果。6.细胞计数方法与要点

6.1细胞计数方法:

细胞计数法是用来计数细胞悬液中细胞数量的一种方法。一般利用计数板(血球计数

板)进行。既可用于分离(散)细胞培养接种前计数所制备的细胞悬液中的细胞数量,也

可用于对培养物的细胞数量进行计数。不论计数的对象如何,均须制备分散的细胞悬液。

计数与计算过程

1)、在细胞计数板中央放置计数专用的盖玻片。

2)、用玻璃虹吸管吸取细胞,让虹吸管在盖玻片上或下侧的计数板凹蹧处流出悬液,

至盖玻片被液体充满为止。

3)、置显微镜下计数四角大方格内的细胞总数。对于压线的细胞只计数在上线和左线

者,对于细胞团按单个细胞计数。

4)、按下式计数细胞悬液的密度:

细胞密度=(4个大格细胞总数/4)×104个/ml×稀释倍数

公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为:

1.0mm(长)×1.0mm(宽)×0.1mm(高)=0.1mm3 而 1ml=1000mm3

6.2细胞计数要点:

A.

进行细胞计数时,要求悬液中细胞数目不低于104个/ml,如果细胞数目很少要进行离心再

悬浮于少量培养液中;显微镜下计数时,遇到2个以上细胞组成的细胞团,应按单个细胞计

算。如果细胞团>10%,说明细胞分散不充分; 或细胞数500个/10 mm2

时,说明稀释不当,需重新制备细胞悬液。

B. 要求细胞悬液中的细胞分散良好,否则影响计数准确性。

C.

取样计数前,应充分混匀细胞悬液,尤其是多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀,

以求计数准确;

D.

数细胞的原则是只数完整的细胞,若细胞聚集成团时,只按照一个细胞计算。如果细胞压

在格线上时,则只计上线,不计下线,只计左线,不计右线。

E. 操作时,注意盖玻片下不能有气泡,也不能让悬液流入旁边槽中,否则要重新计数。

7.初学者易犯的错误:

A. 计数前未将待测悬液吹打均匀。

B. 滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。

C. 滴入悬液时的量太多,至使细胞悬液流入旁边的槽中。

8. 生产企业

企业名称:天津市灏洋生物制品科技有限责任公司

地址:中国医学科学院生物医学工程研究所2号楼2层

天津市南开区白堤路 236 号 201-216(科技园)

邮政编码:300192

电话:15822121119 15822691119

传真:022-87894017

网址:www.tbdscience.com

邮箱:gx15822121119@163.com

9. 参考文献

[1] Meier C, Middelanis J, Wasielewski B, et al. Spastic paresis after

perinatal brain damage in rats Is reduced by human cord blood mononuclear

cells[J]. Pediatric Research, 2006,59(2):244-249.

[2] Boyle AJ, Schulman SP, Hare JM , et al. Stem cell therapy for cardiac

repair:ready for the next step[J]. Circulation, 2006, 114(4):339-352.

[3] 程范军,邹 萍,杨汉东,等.人脐血间充质干/

祖细胞诱导为心肌样细胞的实验研究[J]. 中华器官移植杂志,2003,24:220-222.

[4]Dennis JE,Charbord P.Origin and differentiation of human and murine stroma [J].Stem Cells,2002,20(3):205.

[5] Yu JC, Daniel TS, Ching PT, et al. Disparate mesenchyme-lineage

tendencies in mesenchymal stem cells from human bone marrow and Umbilical Cord

Blood[J]. Stem Cells, 2006,24(3) : 679-685.

[6] Compagnoli C, Roberts IAG, Kumar S, et al. Identification of mesenchymal

stem/progenitor cells in human first trimester fetal blood, liver and bone

marrow[J]. Blood, 2001,98:2396-2402.

[7] Miura M, Gronthos S, Zhao M, et al. SHED: stem cells from human

exfoliated deciduous teeth[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2003,100:5807–5812.

[8] 迟作华, 张 洹, 何冬梅, 等. 脐血间充质干细胞培养条件的优化[J].

中国实用内科杂志,2006, 26(5):372-375.

[9] 向 静, 江德鹏, 王昌铭,等.

的表达[J]. 脐血单个核细胞体外培养和诱导后神经干细胞标志物mRNA

重庆医科大学学报,2005 ,30 (3):352-355.

[10] 孙海梅,季凤清,李荣平,等.不同培养条件下人脐血间充质干细胞的差异[J].

***,2006, 10( 45 ):51-53.

[11] 朱美玲,伍新尧,陈汝光,等.不同分离方法分离脐血造血细胞效率的比较[J].

中国输血杂志,2002 , 15 (3):179-780.

[12]

郑德先,吴克复,褚建新.现代实验血液学研究方法与技术.北京医科大学中国协和医科大

学联合出版社,1999.

[13] 鄂征.组织培养.北京出版社,1995.

[14] 朱立平,陈学清.免疫学常用实验方法.人民军医出版社,2000.

范文六:大鼠脏器组织淋巴细胞分离方法

1.实验前准备

2.使用方法说明及图例

2.1血液样本分离液使用说明及图例

2.2组织分离液使用说明及图例

3.HES-TBD550使用说明

4.组织单细胞悬液的制备

5.注意事项

6.性能指标

7.生产企业

8.参考文献

1. 实验前准备

A.试剂

大鼠脏器组织淋巴细胞分离液(货号:LTS1083P)、全血及组织稀释液、细胞洗涤液

、羟乙基淀粉550、胎牛血清

B.器材

玻璃离心管、玻璃滴管

水平转子离心机、无菌工作台

2. 使用方法说明及图例

2.1 血液样本分离液使用说明及图例

A. 小量分离-使用1-2ml新鲜抗凝血(分离图例见图例1):

a. 取新鲜抗凝血1-2ml,与全血及组织稀释液(Cat#:2010C1119)1:1 混匀;

b. 小心加于与混合液等体积的细胞分离液之液面上;

c. 以400g(约1500转/分)离心15分钟(半径15cm水平转子);

第二层细胞放入含4-

5ml细胞洗涤液(Cat#:2010X1118)的试管中,充分混匀后,以500g(约1800转/分)离心

20分钟,弃去上清留沉淀细胞重新悬起。重复洗涤2次即得所需细胞。B. 中量分离-使用5-10ml新鲜抗凝血(分离图例见图例1):

a. 取新鲜抗凝血5-10ml,与全血及组织稀释液(Cat#:2010C1119)1:1 混匀;

b. 将混合液小心叠加于细胞分离液之液面上(混合液:分离液=2:1);

c. 以500g(约1800转/分)离心15分钟(半径15cm水平转子);

第二层细胞放入含10ml

细胞洗涤液(Cat#:2010X1118)的试管中,充分混匀后,以500g(约1800转/分)离心20

分钟,弃去上清留沉淀细胞重新悬起。重复洗涤2次即得所需细胞。C. 大量分离I-使用20ml新鲜抗凝血(分离图例见图例2):

a. 取新鲜抗凝血20ml以200g(约1100转/分)离心20分钟弃去血浆;

b. 向弃去血浆的血细胞中加入全血及组织稀释液(Cat#:2010C1119)12ml 小心混匀;

c. 将混合液小心叠加于细胞分离液之液面上(混合液:分离液=2:1);

d. 以600g(约2000转/分)离心15分钟(半径15cm水平转子);

第二层细胞放入含20ml

细胞洗涤液(Cat#:2010X1118)的试管中,充分混匀后,以500g(约1800转/分)离心20

分钟,弃去上清留沉淀细胞重新悬起。重复洗涤2次即得所需细胞。D. 大量分离II-使用50ml新鲜抗凝血(分离图例见图例3):

a. 取新鲜抗凝血50ml

30分钟。吸取混浊的上清液备用,弃去底部红细胞。

b. 将步骤1中留取的上清液以200g(约1100转/分)离心20分钟弃去上清保留沉淀细胞;

c. 向沉淀的细胞中加入全血及组织稀释液(Cat#:2010C1119)20ml 小心混匀;

d. 将混合液小心叠加于细胞分离液之液面上(混合液:分离液=2:1);

e. 以600g(约2000转/分)离心15分钟(半径15cm水平转子);

收集第二层细胞放入含20ml

细胞洗涤液(Cat#:2010X1118)的试管中,充分混匀后,以500g(约1800转/分)离心20

分钟,弃去上清留沉淀细胞重新悬起。重复洗涤2次即得所需淋巴细胞。

注:提取率大于90%。

血液(人)中各细胞含量参考值:红细胞男:4.0-5.5×1012/L(400-550万个/mm3)

白细胞

血小板

白细胞分类计

数女:3.5-5.0×10

12

/L(350-500万个/mm3)新生儿:6.0-7.0×1012/L(600-700万个/mm3)成人:4.0-10.0×109/L(4000-10000个/mm3)新生儿:15.0-20.0×109/L(15000-20000个/mm3)100-300×109/L(10万-30万个/mm3)名称占白细胞总数百分比嗜中性粒细胞30%-70%嗜酸性粒细胞0.5%-5%嗜碱性粒细胞0%-1%

淋巴细胞20%-40%

单核细胞3%-8%

分离图例3

抗凝血50ml与HES-TBD550 1:1混合后再与1份注射用生理盐水混匀20℃-30℃静置20-30分钟

2.2 组织分离液使用说明及图例

A.取组织匀浆单细胞悬液(细胞浓度为2×108-

1×109个/ml,具体制备方法参照“4.组织单细胞悬液的制备”)2ml,小心加于2ml细胞分

离液之液面上;

B.以400g(约1500转/分)离心15分钟(半径15cm水平转子);

第二层细胞放入

含4-

5ml细胞洗涤液(Cat#:2010X1118)的试管中,充分混匀后,以500g(约1800转/分)离心

20分钟,弃去上清留沉淀细胞重新悬起。重复洗涤2次即得所需淋巴细胞。3.

HES-TBD550使用说明

HES

是从支链淀粉衍生出来的,是富含淀粉的复合物,其生理和化学特性主要由羟乙基取代度

即取代级、平均分子量决定。大量实验表明平均分子量越大对红细胞的凝集作用越强,有

效提高红细胞的沉降速度,从而使红细胞与其它细胞分离。故而,使用HES-

TBD550(羟乙基淀粉 550)沉淀法是一种高效的细胞分离方法。

间充质干细胞(mesenchymal stem cells ,MSCs)

是指一群可向成骨细胞、成脂肪细胞、骨髓基质细胞、肝脏细胞、心肌细胞和神经细胞等

多种细胞分化的多潜能组织干细胞,是在细胞治疗、基因治疗中有效发挥作用的理想工程细

胞。MSCs

不仅存在于骨髓,也可从脐血、外周血中以及脂肪组织、肌肉、胎儿器官、大脑、牙齿中分

离。UCB - MSCs

的分离、筛选、增殖、分化与脐血样本的选择、培养基的差异以及分离、扩增分化过程中

操作技术等多种因素有关。目前用于UCB - MSCs

分离的方法有:贴壁筛选法、密度梯度离心法、流式细胞仪法和免疫磁珠法。流式细胞仪法

对细胞损伤较大,免疫磁珠法价格相对较贵且由于抗原抗体反应也容易改变细胞原有特性

,而HES-TBD550(羟乙基淀粉 550)联合密度梯度离心法常与贴壁筛选法结合使用,可提高所得 UCB - MSCs

的纯度,目前研究多采用此法。国内不少学者采用羟乙基淀粉沉淀红细胞,然后再进行离

心分离单个核细胞,也取得不错结果。实验证明采用随机数字表法,将每份脐血随机分入

两个不同处理组,从而将脐血样本的个体差异减小到最小程度。结果证实,HES-

TBD550(羟乙基淀粉 550)联合密度梯度离心法获得的有核细胞数量明显多于 FICOLL

密度梯度离心法。本实验采用的羟乙基淀粉商品名为

550),克分子渗透压为308mosm/L,胶体渗透压为68/36 HES-TBD550(羟乙基淀粉 mmHg,可影响红细胞集聚性沉降率。红细胞集聚是可递性桥接结构形成的结果,由大的HES-

TBD550(羟乙基淀粉 550)分子处在红细胞之间联接而成。HES-TBD550(羟乙基淀粉 550)同时还阻碍白细胞和内皮细胞的黏附,并使平均血小板容积呈现微弱地降低,从而有

轻度抑制血小板集聚的功能。脐血经HES-TBD550(羟乙基淀粉 550)处理后,可使红细胞沉积至试管底,对其它主要成分包括干细胞无影响。经这样处理

后,实验时间相对较短(平均为1.5

h),步骤相对较少,细胞污染几率小,从而使细胞数损失减少。结论证明,与相应的干细

胞分离液联合分离使用羟乙基淀粉沉淀法是一种高效的脐血干细胞分离方法。

4. 组织单细胞悬液的制备

注:A.

本说明只提供机械匀浆制备单细胞悬液的方法,酶消化法由于各实验室选取的消化酶种类

各不相同,请各实验室自行选择进行试验。

B. 全过程及所需试剂要求无菌环境。

剪碎法:将组织块放入平皿后,加入少量组织匀浆液及20%胎牛血清;用眼科剪将组织剪至

匀浆状,加入5ml组织匀浆液及20%胎牛血清;用吸管吸取组织匀浆,用100目不锈钢滤网(

另购)过滤到试管内;离心沉淀1500转/分×3

min,再用细胞洗涤液清洗3次,每次以500rpm短时低速离心除去细胞碎片,以200目不锈钢

滤网(另购)过滤去细胞团块。作细胞计数并调整细胞浓度为(2~5)×107个/ml。常温

下放置,

待测细胞的活力。分离前用20%胎牛血清或全血及组织稀释液悬起细胞浓度为2×108-

1×109个/ml的单细胞悬液备用。

匀浆器法:用眼科剪将组织剪成小块;放入70ml组织研磨器内,加入2ml组织匀浆液及20%

胎牛血清;缓慢转动研棒,研磨至匀浆;用5ml组织匀浆液及20%胎牛血清冲洗研器;收集

细胞悬液,经200目不锈钢滤网(另购)过滤;离心沉淀800rpm×2min

,再用细胞洗涤液洗3次,离心沉淀。作细胞计数并调整细胞浓度为(2~5)×107个/ml。

常温下放置,

待测细胞的活力。分离前用20%胎牛血清或全血及组织稀释液悬起细胞浓度为2×108-

1×109个/ml的单细胞悬液备用。

细胞计数方法:

细胞计数法是用来计数细胞悬液中细胞数量的一种方法。一般利用计数板(血球计数

板)进行。既可用于分离(散)细胞培养接种前计数所制备的细胞悬液中的细胞数量,也

可用于对培养物的细胞数量进行计数。不论计数的对象如何,均须制备分散的细胞悬液。

计数与计算过程

1)、在细胞计数板中央放置计数专用的盖玻片。

2)、用玻璃虹吸管吸取细胞,让虹吸管在盖玻片上或下侧的计数板凹蹧处流出悬液,

至盖玻片被液体充满为止。

3)、置显微镜下计数四角大方格内的细胞总数。对于压线的细胞只计数在上线和左线

者,对于细胞团按单个细胞计数。

4)、按下式计数细胞悬液的密度:

细胞密度=(4个大格细胞总数/4)×104个/ml×稀释倍数

公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为:

1.0mm(长)×1.0mm(宽)×0.1mm(高)=0.1mm3 而 1ml=1000mm3

细胞计数要点:

A.

进行细胞计数时,要求悬液中细胞数目不低于104个/ml,如果细胞数目很少要进行离心再

悬浮于少量培养液中;显微镜下计数时,遇到2个以上细胞组成的细胞团,应按单个细胞计

算。如果细胞团>10%,说明细胞分散不充分; 或细胞数500个/10 mm2

时,说明稀释不当,需重新制备细胞悬液。

B. 要求细胞悬液中的细胞分散良好,否则影响计数准确性。

C.

取样计数前,应充分混匀细胞悬液,尤其是多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀,

以求计数准确;

D.

数细胞的原则是只数完整的细胞,若细胞聚集成团时,只按照一个细胞计算。如果细胞压

在格线上时,则只计上线,不计下线,只计左线,不计右线。

E. 操作时,注意盖玻片下不能有气泡,也不能让悬液流入旁边槽中,否则要重新计数。

初学者易犯的错误:

A. 计数前未将待测悬液吹打均匀。

B. 滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。

C. 滴入悬液时的量太多,至使细胞悬液流入旁边的槽中。

5. 注意事项

A. 本分离液是敏光型的,在运输和贮藏过程中应在18℃-

25℃避光保存,启封后置4℃保存避免微生物污染。另外,本品为真空包装,未启封前置于

10℃ 以下易出现白色结晶,影响分离效果。

B.

待分离的血液、组织及细胞要求新鲜,避免冷冻和冷藏。分离液和所分离样本一定在20℃

水浴箱中复温20分钟保证分离液和所分离样本温度在20℃±2℃时分离效果最好,且所有操

作过程一定要在无菌条件下进行。

C.

由于各品牌离心机的性能不同,国内南北地区温度环境和四季的差异,可能影响分离效果

,用户可以调节离心转数,调节离心的时间,摸索最佳的分离条件(具体分离条件各实验

室自定)。

D. 最好使用无静电反应的离心管,推荐使用未经过碱处理的玻璃离心管。

E.

最优抗凝剂选择:EDTA、枸橼酸、肝素。应注意在血液稀释过程中应去除抗凝剂体积。

F.

分离过程中所用其他试剂如:羟乙基淀粉550、全血及组织稀释液、细胞洗涤液及红细胞裂

解液等以我公司产品为最优选择,本公司相关系列产品无菌、无病毒、无支原体、低内毒素水平且无细胞毒性,所获得的细胞可保持完好的生物活性和完整的细胞形态。

pH   7.0-7.5

渗透压  280-340mOsmol/kg

内毒素 ≤0.5EU/ml

无菌 直接接种培养14天后培养基澄清

澄明度及不溶性颗粒物 每50ml溶液中含10μm以上的不溶性微粒20粒以下,含25μm以上的不溶性微粒5粒以下贮藏及保存期限

18℃-25℃避光保存,有效期两年。启封后置4℃保存,有效期一周。

注:若保证无微生物污染,启封后可置4℃长期保存。但应注意保存温度较低时本分离液易出现白色结晶,影响分离效

果。

8. 生产企业

企业名称:天津市灏洋生物制品科技有限责任公司

地址:中国医学科学院生物医学工程研究所2号楼2层

天津市南开区白堤路 236 号 201-216(科技园)

邮政编码:300192

电话:15822121119 15822691119

传真:022-87894017

网址:www.tbdscience.com

邮箱:gx15822121119@163.com

9. 参考文献

[1] Meier C, Middelanis J, Wasielewski B, et al. Spastic paresis after

perinatal brain damage in rats Is reduced by human cord blood mononuclear

cells[J]. Pediatric Research, 2006,59(2):244-249.

[2] Boyle AJ, Schulman SP, Hare JM , et al. Stem cell therapy for cardiac

repair:ready for the next step[J]. Circulation, 2006, 114(4):339-352.

[3] 程范军,邹 萍,杨汉东,等.人脐血间充质干/

祖细胞诱导为心肌样细胞的实验研究[J]. 中华器官移植杂志,2003,24:220-222.

[4]Dennis JE,Charbord P.Origin and differentiation of human and murine stroma [J].Stem Cells,2002,20(3):205.

[5] Yu JC, Daniel TS, Ching PT, et al. Disparate mesenchyme-lineage

tendencies in mesenchymal stem cells from human bone marrow and Umbilical Cord

Blood[J]. Stem Cells, 2006,24(3) : 679-685.

[6] Compagnoli C, Roberts IAG, Kumar S, et al. Identification of mesenchymal

stem/progenitor cells in human first trimester fetal blood, liver and bone

marrow[J]. Blood, 2001,98:2396-2402.

[7] Miura M, Gronthos S, Zhao M, et al. SHED: stem cells from human

exfoliated deciduous teeth[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2003,100:5807–5812.

[8] 迟作华, 张 洹, 何冬梅, 等. 脐血间充质干细胞培养条件的优化[J].

中国实用内科杂志,2006, 26(5):372-375.

[9] 向 静, 江德鹏, 王昌铭,等.

的表达[J]. 脐血单个核细胞体外培养和诱导后神经干细胞标志物mRNA

重庆医科大学学报,2005 ,30 (3):352-355.

[10] 孙海梅,季凤清,李荣平,等.不同培养条件下人脐血间充质干细胞的差异[J].

***,2006, 10( 45 ):51-53.

[11] 朱美玲,伍新尧,陈汝光,等.不同分离方法分离脐血造血细胞效率的比较[J].

中国输血杂志,2002 , 15 (3):179-780.

[12]

郑德先,吴克复,褚建新.现代实验血液学研究方法与技术.北京医科大学中国协和医科大

学联合出版社,1999.

[13] 鄂征.组织培养.北京出版社,1995.

[14] 朱立平,陈学清.免疫学常用实验方法.人民军医出版社,2000.

范文七:淋巴细胞分离

淋巴细胞分离与计数

淋巴细胞分离

原理:

外周血各种血细胞的密度不尽相同,利用淋巴细胞分层液(Ficoll)作密度梯度离心,使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布,从而将各种血细胞加以分离。

实验材料:

淋巴细胞分离液

肝素

稀释液(生理盐水)

RPMI1640粉末

实验设备:1ml移液器、移液管、 5ml注射器、刻度吸管、EP管、离心机、显微镜

操作流程:

1. 在离心管中加入适量淋巴细胞分离液。

2. 无菌采集静脉血若干毫升,注入盛有肝素的无菌小瓶中,(每1ml全血加

0.1ml 125-250U/ml肝素溶液),加盖后立即轻轻摇匀,使血液抗凝

3. 稀释(外周血:稀释液=1:2 取肝素抗凝血与等量生理盐水充分混

匀)

4. 用刻度吸管沿倾斜的管壁,把稀释血缓慢叠加于分层液面上,注意保持清

楚的界面 (Ficoll:稀释血=1:2)

5. 放入离心机1500r/min 离心20min(注:缓慢加速1-4档个3分钟 )

6. 用吸管插到云雾层,吸取单个核细胞。置入另一离心管中,加入5倍以上

体积的稀释液(生理盐水),1500rpm×10分钟离心,洗涤细胞。

7. 重复洗涤一次,1500rpm×10分钟离心。

8. 末次离心后,弃上清,加入含有10%小牛血清的RPMI1640,重悬细胞

9. 计数细胞后再调整细胞置所需浓度.

10. 取一滴细胞悬液与一滴0.2%台盼兰染液混合,于血球计数板上,计数四个

大方格内的细胞总数。

单个核细胞浓度(细胞数/1毫升细胞悬液)=

4个大方格内细胞总数

────────── × 104×2(稀释倍数)

4

11. 分离出的淋巴细胞置于培养瓶中二氧化碳培养箱培养。

注意事项:

1. 每毫升外周血液大约可获1×106单个核细胞

2. Ficoll应适量,外周血应充分稀释

3. 温度直接影响到Ficoll的比重和分离效果

4. 在Ficoll上加入稀释外周血时,应缓慢加,以免冲散界面

5. 吸取单个核细胞层时,应避免吸出过多的上清液或分层液而导致血小板污

淋巴细胞计数:

实验流程:

1. 准备计数板:

2. 制备细胞悬液:收集细胞,制成单个细胞悬液

3. 加样:用吸管轻轻吹打细胞悬液,取少许细胞悬液,在计数板上盖玻片的

一侧加微量细胞悬液,

4. 计数:在显微镜下,用10×物镜观察计数板四角大方格中的细胞数

5. 计算:将结果代入下式,得出细胞密度

胞数/毫升原

=(4大格细胞数之和/4)×104

注意事项:

1. 取样计数前,应充分混匀细胞悬液

2. 加样量不要溢出盖玻片,也不要过少或带气泡

3. 细胞压中线时,数上不数下,数左不数右

4. 本法要求细胞密度不低于104细胞/ml

5. 镜下计数时,细胞数过少或过多,说明稀释不当,需重新制备细胞悬液、

计数



范文八:淋巴细胞分离液

Lymphocyte Separation Medium(淋巴细胞分离液)

Density(密度) = 1.077-1.080 g/mL at 20oC

【分离目的】

方便在人体外对机体各种免疫细胞分别作鉴定,计数或功能测定。

淋巴细胞分离以后可以做淋巴细胞抗原片制备,E花环试验,淋巴细胞转化试验,淋巴细胞培养(需无菌操作)

【分离原理】

人 淋巴细胞的方便来源是外周血,分离的原则是收率较高,纯度较好,失活较低,根据不同试验有相对纯度,无论采用哪种方法,应尽最大可能保持细胞应有活性。分 离的技术可根据细胞的物理性状和表面标志设计,根据不同实验目的可采用密度梯度离心法、吸附分离法和其它特殊分离法。此次实验采用的1就是密度梯度离心法。其原理是:人外周血中各种细胞的密度不同,人红细胞密度为1.093,粒细胞为1.092,淋巴细胞为1.074±0.001。密度梯度离心法的原理主要根据各类血细胞比重的差异,利用比重介于某两类细胞之间的细胞分离液对血液离心,使一定比重的血细胞依相应的密度梯度分布于不同的独立带,从而达到分离的目的。

【材料】

1、肝素抗凝管,普通管(负压),采血针,血清收集管

2、淋巴细胞分离液(比重1.077 – 1.080 g/mL)。

3、无Ca++、Mg++、Hank's 液

4、刻度吸管、毛细吸管、离心管、离心机等。

5置于冰箱的冷丙酮(固定细胞,保持细胞的完整性)

【方法】

1.采静脉血2ml加入肝素抗凝管(或枸橼酸钠),3ml加入普通管。

2.普通管斜面放置30MIN,此时可分离淋巴细胞。用竹签将血块轻轻剥离管壁(主张用玻璃棒),2000rPm离心20分钟,用毛细吸管吸取上清(血清)于血清收集管中,于4℃冰箱保存备用,用于以后的ELISA实验,对流免疫电泳实验和伤寒试管凝集实验,溶血反应,免疫比浊测定补体C3或C4等等。(剥离时也可用毛细吸管轻轻剥离)

3.趁普通管放置30MIN时,将装有静脉血2ml加入肝素抗凝管(或枸橼酸钠)轻轻摇动使血液与抗凝剂混匀,出现凝集不能继续实验。5min后加入Hank's 液2ml,手动轻轻摇匀。

4.用毛细吸管吸取抗凝血,将抗凝血全部沿管壁缓慢加至另一含2ml淋巴细胞分离液

液面上,注意保持两种液体界面清晰。

5.将试管平衡后置水平式离心机,2000rpm离心10min。

6.用毛细吸管仔细吸取血浆与分层液界面处淋巴细胞层至一刻度离心管内。

7.加入Hank's 液5ml,手动旋转试管使液体混匀,2000rpm离心10min,弃上清,沉淀即主要为淋巴细胞(或单位个核细胞)。

备注:如做淋巴细胞转化或其它培养,所用试剂、器材应是无菌的。Hank's 液为缓冲等渗液,类似营养液,保持细胞活性及完整性,可抵抗轻微的酸碱变化。

【难点】

1.将抗凝血与Hank's 液的混合液加入淋巴细胞分离液时,必须保持两种液体界面清晰。

2.用毛细吸管吸取淋巴细胞层时,要掌握好力度,在细胞层上作各个方向的吸取,勿吸到其它层的液体或细胞,吸取时勿使各层细胞相混。

离心示意图如下



范文九:淋巴细胞分离

这是鄂征的《组织培养技术及其在医学研究中的应用》中关于分裂淋巴细胞的方法,可供参考。

1.概述:枸橼酸处理的全血,或加葡聚糖加速沉积去除红细胞的血浆,在Percoll-Paque分层液上分出致密层。离心后,大多数淋巴细胞会积聚在Ficoll/Metrizoate(Ficoll/甲泛葡胺)和血浆之间。

2.方法:

(1)枸橼酸或肝素抗凝血携入操作室或HOOD台面

(2)用PBSA按1:1稀释,用9ml加入6mlPercoll-Paque分层液中进行分层,注入容量较大的、而且透明不带盖的离心管中,平衡

(3)400×g离心15分钟

(4)在不干扰交界面情况下,小心去除血浆/PBSA

(5)用注射器或吸管吸出交界面液体(吸时最好用钝圆针头或吸管,而不要用尖的头吸

(6)用20ml不含血清培养液稀释

(7)从交界面来的稀释细胞悬浮,70g离心10分钟

(8)去掉上清,重悬沉积物于2ml不含血清培养液中;如果需要去掉血清中因子,可用20ml无血清培养基反复漂洗、离心2~3次后,最后把沉积悬于2ml不含血清培养基中

(9)取少许细胞样品,台盼蓝染色,细胞计数器检测含有核的细胞数

(10)接种入无血清或加血清培养基中培养

注解:在第(3)步骤沉降中,淋巴细胞集中在杂有一些血小板和单核细胞的交界面上,可能也有一些粒性白细胞。如欲获纯淋巴细胞,由于单核和粒性白血病喜欢贴壁,可采用贴壁法进行排除,如向悬液中置入无菌载物玻璃片,过一定时间,这些细胞便可附着其上,抽出玻璃片弃掉;或把悬液注入培养瓶或皿中,在镜下观察,过一定时间(10~30分钟),这些细胞如先贴附,而淋巴细胞尚处在悬浮状态下,把悬液倒入另瓶中即可。当然也可应用更加复杂的方法如流式细胞仪等分离亦可

所有的细胞培养都应该坚守无菌操作原则

2.分层后的确有3层,准确说来是4层,最下面是红细胞,上面的一层不应该是稍微混浊的白色,应该也比较透明,这一层上面就是我们需要的薄细胞层,最上面是血清

3.细节:

a.淋巴细胞分离液要避光保存

b.就您的试验看来,淋巴细胞分离液的问题可能是最主要的

c.首先再离心管中加入淋巴细胞分离液,然后把标本缓慢加在淋巴细胞分离液表面上,一定要缓慢小心操作,切不可混匀

d.所有操作都应在无菌环境进行

e.把离心管放入离心机是也应小心,不要太大幅度的摇幌离心管,当然离心后拿出来也要小心

就这么多了吧,这个操作是不是很难的,比较基本

祝您好运了!

补充两点:

1.淋巴细胞分离液在使用前需从4度冷藏取出室温平衡30min.没有此步操作易导致分离失败.

2.全血的抗凝一定要充分,不然就会很难出现漂亮的白膜层.即你的(紧接着是一层稍微混浊的白色大概有2CM)

3.离心转数一般为2000转,25min.

尝试改进下,应该很容易分离的.

范文十:淋巴细胞分离液

使用美国Mediatech公司的cellgro淋巴细胞分离液,可显著提高分离率,分离层间隔清晰。货号:25-072-CV

Lymphocyte Separation Medium(淋巴细胞分离液)

Density(密度) = 1.077-1.080 g/mL at 20oC

【分离目的】

方便在人体外对机体各种免疫细胞分别作鉴定,计数或功能测定。

淋巴细胞分离以后可以做淋巴细胞抗原片制备,E花环试验,淋巴细胞转化试验,淋巴细胞培养(需无菌操作)

【分离原理】

人 淋巴细胞的方便来源是外周血,分离的原则是收率较高,纯度较好,失活较低,根据不同试验有相对纯度,无论采用哪种方法,应尽最大可能保持细胞应有活性。分 离的技术可根据细胞的物理性状和表面标志设计,根据不同实验目的可采用密度梯度离心法、吸附分离法和其它特殊分离法。此次实验采用的1就是密度梯度离心法。其原理是:人外周血中各种细胞的密度不同,人红细胞密度为1.093,粒细胞为1.092,淋巴细胞为1.074±0.001。密度梯度离心法的原理主要根据各类血细胞比重的差异,利用比重介于某两类细胞之间的细胞分离液对血液离心,使一定比重的血细胞依相应的密度梯度分布于不同的独立带,从而达到分离的目的。

【材料】

1、肝素抗凝管,普通管(负压),采血针,血清收集管

2、淋巴细胞分离液(比重1.077 – 1.080 g/mL)。

3、无Ca++、Mg++、Hank's 液

4、刻度吸管、毛细吸管、离心管、离心机等。

5置于冰箱的冷丙酮(固定细胞,保持细胞的完整性)

【方法】

1.采静脉血2ml加入肝素抗凝管(或枸橼酸钠),3ml加入普通管。

2.普通管斜面放置30MIN,此时可分离淋巴细胞。用竹签将血块轻轻剥离管壁(主张用玻璃棒),2000rPm离心20分钟,用毛细吸管吸取上清(血清)于血清收集管中,于4℃冰箱保存备用,用于以后的ELISA实验,对流免疫电泳实验和伤寒试管凝集实验,溶血反应,免疫比浊测定补体C3或C4等等。(剥离时也可用毛细吸管轻轻剥离)

3.趁普通管放置30MIN时,将装有静脉血2ml加入肝素抗凝管(或枸橼酸钠)轻轻摇动使血液与抗凝剂混匀,出现凝集不能继续实验。5min后加入Hank's 液2ml,手动轻轻摇匀。

4.用毛细吸管吸取抗凝血,将抗凝血全部沿管壁缓慢加至另一含2ml淋巴细胞分离液

液面上,注意保持两种液体界面清晰。

5.将试管平衡后置水平式离心机,2000rpm离心10min。

6.用毛细吸管仔细吸取血浆与分层液界面处淋巴细胞层至一刻度离心管内。

7.加入Hank's 液5ml,手动旋转试管使液体混匀,2000rpm离心10min,弃上清,沉淀即主要为淋巴细胞(或单位个核细胞)。

备注:如做淋巴细胞转化或其它培养,所用试剂、器材应是无菌的。Hank's 液为缓冲等渗液,类似营养液,保持细胞活性及完整性,可抵抗轻微的酸碱变化。

【难点】

1.将抗凝血与Hank's 液的混合液加入淋巴细胞分离液时,必须保持两种液体界面清晰。

2.用毛细吸管吸取淋巴细胞层时,要掌握好力度,在细胞层上作各个方向的吸取,勿吸到其它层的液体或细胞,吸取时勿使各层细胞相混。

离心示意图如下

上海科页仪器科技有限公司